en استفاده از روش کلون سازی seamless و بدون نیاز به آنزیم محدودالاثر برای تولید استرپتولایزین o نوترکیب متصل به برچسب هیستیدین با پایانه آمین دست نخورده ژنتیک/ بیوتکنولوژی Genetics/ Biotechnology پژوهشي Research <p dir="RTL">پیش گفتار</p> <p dir="RTL">کلون سازی<span dir="LTR"> DNA</span>، ساب کلون سازی و روش های جهش زایی هدفدار استراتژی های معمول در اکثر پروژه های تولید پروتئین نوترکیب هستند. روش های قدیمی کلون سازی بوسیله آنزیم های محدودکننده به دلیل نیاز به این آنزیم ها و ناکارایی واکنش دابل دایجست چندان مورد پسند نیستند. بسیاری از روش های جدید مانند کلون سازی به روش نوترکیبی و روش های کلون سازی مستقل از لایگیشن نیز نیاز به آنزیم ها و کیت هایی دارند که همیشه در دسترس نیستند. در این طرح ما از روش کلون سازی&nbsp; بدون درز<span dir="LTR"> seamless </span>و بدون نیاز به آنزیم محدود کننده استفاده کردیم تا ژن 1.6کیلوبازی استرپتولایزین<span dir="LTR"> O </span>کامل را بدون اینکه از هیچ آنزیم غیر معمول تجاری استفاده کنیم در یک وکتور بیانی وارد کنیم<span dir="LTR">. </span></p> <p dir="RTL">مواد و روش ها</p> <p dir="RTL">&nbsp;قطعه ژن استرپتولیزین<span dir="LTR"> O </span>با یک واکنش زنجیره ای پلیمرازی ساده تکثیر شد و سپس به وسیله واکنش زنجیره ای پلیمرازی تغییر سریع وارد پلاسمید شد. بطور همزمان ژن استرپتولیزین<span dir="LTR"> O </span>با کمک آنزیم های محدود کننده<span dir="LTR"> XhoI </span>و<span dir="LTR"> NcoI </span>وارد حامل بیانی<span dir="LTR"> pET28a </span>شد. هر دو پروتئین نوترکیب بوسیله القاکننده<span dir="LTR"> IPTG </span>در باکتری<span dir="LTR"> E coli </span>سویه<span dir="LTR"> BL21 </span>بیان شده و بوسیله کروماتوگرافی میل ترکیبی ستون نیکل تخلیص شد. فعالیت همولیزی توکسین ها بوسیله اسپکتروفتومتری و با استفاده از گلبول قرمز انسانی رقیق شده مورد ارزیابی قرار گرفت<span dir="LTR">. </span></p> <p dir="RTL">نتایج :</p> <p dir="RTL">قطعه ژن استرپتولایزین <span dir="LTR">O</span> پس از ساب کلون سازی به وکتورهای بیانی <span dir="LTR">pET28a</span> و <span dir="LTR">pPSG-IBA35</span> بدون هیچگونه سمیتی در ستوپلاسم باکتری به ترتیب با برچسب هیستیدنی در پایانه کربوکسیلی و پایانه آمینی پروتئین بیان شدند و تخلیص آنها با خلوص بالای 90 درصد به وسیله ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی انجام شد. فعالیت پروتئین تخلیص شده با تست همولیز مورد سنجش قرار گرفت که <span dir="LTR">IC50</span> پروتئین با برچسب های هیستیدنی پایانه کربوکسیلی و آمینی به ترتیب 0.22 و 0.29 میکروگرم بر میلی لیتر بود.</p> <p dir="RTL"></p> <p dir="RTL">نتیجه گیری :</p> <p dir="RTL">این مقاله برای اولین بار نشان می دهد که توکسین ایجاد کننده منفذ استرپتولایزن<span dir="LTR"> O </span>با طول کامل و عملکردی می تواند در ستوپلاسم <em><span dir="LTR">E. coli</span></em> بدون هیچگونه سمیتی برای باکتری بیان شود. تنها آمینواسیدهای اضافه شده به پروتئین برچسب هیستیدن است. در همه انواع<span dir="LTR"> SLO </span>نوترکیب که در متون قبل ذکر شده اند، تعداد زیادی برچسب آمینو اسیدی یا تعداد زیادی آمینو اسید از بدنه وکتور به پروتئین اضافه شده است. برای مطالعه نقش این توکسین در پروسه عفونت بهتر است که پروتئین<span dir="LTR"> SLO </span>نوترکیب با این استراتژی بیان شود تا آمینو اسید یا برچسب های کمتری در پروتئین قرار گیرد<span dir="LTR">.</span></p> <div style="text-align: justify;"><strong>Background and Aims</strong>: DNA cloning, sub-cloning and site directed mutagenesis are the most common strategies in nearly all projects of recombinant protein production. The classical method of restriction site cloning is unsatisfactory due to the need for supply of restriction enzymes and the inefficiency of the digestion reaction. Many new methods, including recombinatorial cloning and ligation independent cloning need additional enzymes and kits. In this project we insert a full-length streptolysin O gene into an expression plasmid without using any uncommon commercial enzymes.<br> <strong>Materials and Methods: </strong>Steptolysin O gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and introduced into the pPSG-IBA35 vector using a quick-change PCR. At the same time the gene was double digested and sub-cloned into pET28a (+). Both constructs were introduced into BL21 DE3 cell. Proteins were purified by Ni-NTA column and hemolytic activity was evaluated by spectrophotometry using human red blood cells.<br> <strong>Results:</strong> Steptolysin O was <em>subcloned</em> into the pET28a (+) and pPSG-IBA35 vectors and expressed in <em>E. coli</em>. Protein was purified with over 90% purity. The IC₅₀ of C and N terminus his-tagged protein were 0.22 and 0.29 &micro;g/ml, respectively in hemolysis assay.<br> <strong>Conclusions: </strong>This study showed for the first time that full-length streptolysin O can be expressed in <em>E. coli</em> cytoplasm without any toxicity for the bacteria itself. The only additional amino acids expressed on the protein were his-tag. To study the role of this toxin it would be better to express the protein with the same strategy to have minimal extra amino acids on the protein.</div> استرپتولایزین O, توکسین منفذساز, کلون سازی seamless Pore forming toxin, Seamless cloning, Streptolysin O 189 200 http://ijml.ssu.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-209-1&slc_lang=en&sid=1 Mohammad Hassan Kheirandish محمد حسن خیراندیش bio71.mohammad@yahoo.com No Department of Medical Genetics, Faculty of Medicine, Shahid Sadoughi University of Medical Sciences, Yazd, Iran. Hossein Zarei Jaliani حسین زارعی جلیانی zarei.j@gmail.com Yes Department of Medical Genetics, Faculty of Medicine, Shahid Sadoughi University of Medical Sciences, Yazd, Iran. 2Department of Advanced Medical Sciences and Technologies, Faculty of Paramedicine, Shahid Sadoughi University of Medical Sciences, Yazd, Iran. Behnaz Rahmani بهناز رحمانی behnazrahmani70@yahoo.com No Department of Medical Genetics, Faculty of Medicine, Shahid Sadoughi University of Medical Sciences, Yazd, Iran.